- Titel
- Räumliche und zeitliche Organisation von subplasmalemmalen Ca2+-Spikes und Fusionsereignissen Insulin-haltiger Vesikel in einem β-Zellmodell
- Zitierfähige Url:
- https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:15-qucosa2-1023338
- Datum der Einreichung
- 25.07.2024
- Datum der Verteidigung
- 08.05.2025
- Abstract (DE)
- Die basale und Glukose-induzierte Insulinfreisetzung aus β-Zellen ist ein streng regulierter Prozess und wird durch Veränderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i), den Einfluss verschiedener Hormone, medikamentöse Interventionen und viele weitere Faktoren moduliert (Ammälä, Ashcroft et al., 1993; Mayendraraj, Rosenkilde et al., 2022). Durch die Arbeit von Langlhofer et al. wurde klar, dass die [Ca2+]i im Bereich subplasmalemmaler Mikrodomänen in Spikes oder Gruppen von Spikes (Bursts) fluktuiert, die eine Höhe von 2-6 µM erreichen und damit ausreichen könnten, um Ca2+-abhängige Sensorproteine zu aktivieren, die ihrerseits die Freisetzung insulinhaltiger Vesikel triggern können. Diese Spikes treten synchronisiert über die ganze INS-1-Zelle auf. Mithilfe des Exozytosemarkers SynaptopHluorin konnten wir zeigen, dass es prinzipiell Fusionsereignisse gibt, die in Einzelzellen nahezu gleichzeitig, d.h. im Zeitraum zwischen 50-150 ms ablaufen. Mittels Zweifarbkanal LED-TIRF (total internal reflection fluorescence)-Mikroskopie führten wir dann Messungen durch, die simultan die Ca2+-Signale mit der PKCαmCherry2 als Indikator und die durch SynaptopHluorin dargestellten Fusionsereignisse abbilden konnten, um herauszufinden, ob eine Ca2+-getriggerte Exozytose zur Freisetzung von mehr als einem Vesikel und damit zum Ansprechen des „readily releasable pool“ (RRP) in INS-1-Zellen führen kann. Wir nutzten dabei verschiedene Techniken und pharmakologische Modulatoren, um Störfaktoren auszuschalten, aber dennoch in einem für die Zellen möglichst physiologischen Umfeld zu arbeiten. Durch die Anwendung von Thapsigargin konnten wir sicherstellen, dass eine Freisetzung aus intrazellulären Ca2+-Speichern nicht zu den Spitzenkonzentrationen der subplasmalemmalen Ca2+-Signale beiträgt, die uns Cal520ff oder die PKCαmCherry2 anzeigen. Um den Einfluss der Ca2+-Mikrodomänen auf die Exozytoseleistung der Zellen zu untersuchen, arbeiteten wir mit verschiedenen Ca2+-Puffersystemen. Wurden die Zellen mit 30 µM EGTA-AM beladen, konnte Cal520ff keine Ca2+-Signale mehr darstellen, einer kompletten Pufferung entsprechend. Das führte zu einer Verminderung der Fusionsrate um 23,3 %. Nach Beladung mit dem schneller puffernden BAPTA-AM in gleicher Konzentration konnte eine noch stärkere und signifikante Verminderung um 44,8 %, unter extrazellulär Ca2+-freien Bedingungen sogar um 57,4 % erreicht werden. Um eine zeitliche Korrelation zwischen Ca2+-Spikes und Exozytoseereignissen festzustellen, setzten wir zunächst einen empirisch gewählten Zeitrahmen von 500 ms, 100 ms vor und 400 ms nach einem Ca2+-Spike. Etwa 65 % aller Fusionsereignisse fanden außerhalb dieses Intervalls statt und wurden somit als asynchron angesehen. Die übrigen 35 % erschienen als synchronisiert, ein Teil davon könnte aber lediglich zufällig in diesem Zeitfenster liegen, ohne kausal durch das akute Ca2+-Signal getriggert worden zu sein. Wurden diese mittels einer mathematischen Kompensation herausgerechnet, so sank die Fraktion synchronisierter Exozytoseereignisse noch einmal um 22 %. Unter zusätzlicher Stimulation mit 20 µM Forskolin stieg zwar die Rate asynchroner Fusionsereignisse stark an, aber die der synchronisierten Fusionen änderte sich nicht signifikant. Ähnliche Ergebnisse erhielten wir unter Zugabe von 50 µM Tolbutamid. Um die Kausalität eines Ca2+-Spikes für eine durch ihn ausgelöste Vesikelfusion genauer zu bestimmen, haben wir einen zusätzlichen Modellierungsansatz entwickelt. Dabei gingen wir davon aus, dass im Fall einer kausal getriggerten Fusion ein Ca2+-Signal vorausgehen, nicht aber folgen sollte. Eine Synchronisation würde sich dann als asymmetrische Poisson-Verteilung des zeitlich nächstliegenden Ca2+-Spikes darstellen, welcher der Fusion mit einem Erwartungswert λ vorauseilt. Nicht kausal zu einer synchronisierten Fusion führende Ca2+-Spikes würden sich hingegen zeitlich symmetrisch um das Fusionsereignis verteilen. Ca2+-Signale wurden durch 5 oder 15 mM Glukose ausgelöst und weiterhin mit Forskolin oder Tolbutamid stimuliert. Die zeitlich nächsten Ca2+-Spikes zu einem Fusionsereignis (Δt < 1 s) wurden in ein Histogramm aufgenommen. Nach Berechnung der Histogramme passten wir die Parameter der Formeln mit Hilfe eines Fehlerminimierungsverfahrens (nicht-lineare Regressionsanalyse) so an, dass sie den Messdaten am besten entsprachen. Viele Fusionsereignisse waren aber nicht von einem Ca2+-Signal im 1-s-Zeitfenster umgeben. Auch wenn sich der Großteil des Histogramms als symmetrisch darstellt, ist vor allem der mittlere Teil leicht asymmetrisch und lässt damit auf kausal durch Ca2+-Spikes getriggerte Events schließen. Nach Stimulation mit Forskolin oder Tolbutamid zeigte sich eine nur leicht erhöhte Synchronisation von 1,6 Events/Minute/Zelle (7,2 %) im Vergleich zu 0,61 Events/Minute/Zelle (5,3 %) vor Stimulation. Diese Erkenntnis wird zusätzlich davon unterstützt, dass die Fusionsereignisse häufig auch räumlich getrennt von den Ca2+-Mikrodomänen abzulaufen schienen. Fusionsereignisse fanden favorisiert im Zentrum des Zellbodens statt, während die Orte der Ca2+-Mikrodomänen eher in Zellausläufern zu finden waren und damit bis zu 20 µm von Fusionsereignissen entfernt stattfanden („loose coupling“).
- Freie Schlagwörter (DE)
- Insulinfreisetzung, beta-Zellen, loose coupling, subplasmalemmale Ca2+-Signale, TIRF-Mikroskopie
- Klassifikation (DDC)
- 610
- GutachterIn
- Prof. Dr. Stefan Jens Hallermann
- Prof. Dr. Wolfgang Nörenberg
- BetreuerIn Hochschule / Universität
- Prof. Dr. Michael Schaefer
- Den akademischen Grad verleihende / prüfende Institution
- Universität Leipzig, Leipzig
- Version / Begutachtungsstatus
- angenommene Version / Postprint / Autorenversion
- URN Qucosa
- urn:nbn:de:bsz:15-qucosa2-1023338
- Veröffentlichungsdatum Qucosa
- 16.02.2026
- Dokumenttyp
- Dissertation
- Sprache des Dokumentes
- Deutsch
- Lizenz / Rechtehinweis
CC BY-NC-ND 4.0- Inhaltsverzeichnis
I Abkürzungsverzeichnis 1 Einführung 1.1 Hochfrequente Glukose-getriggerte Ca2+-Spikes als Exozytosesignal 1.2 Signalwege der Insulinsekretion 1.2.1 Ca2+-abhängige Insulinsekretion 1.2.2 Ca2+-unabhängige Insulinsekretion 1.3 Fragestellung 1.4 Zur Beantwortung der Fragestellung gewählte Methoden 1.4.1 Ca2+-Indikatoren 1.4.2 Darstellung der Exozytoseereignisse 1.4.3 Zweifarbkanal LED-TIRF-Mikroskopie 2 Publikation 3 Zusammenfassung und Ausblick 4 Literaturverzeichnis II Darstellung des eigenen wissenschaftlichen Beitrags III Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit IV Lebenslauf V Verzeichnis der wissenschaftlichen Veröffentlichungen VI Danksagung