- Titel
- Etablierung und Optimierung von Isolationsmethoden primärer humaner Hepatozyten und Hepatomazellen und deren Charakterisierung zur Anwendbarkeit in der Lebertumorforschung
- Zitierfähige Url:
- https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:15-qucosa2-1039520
- Datum der Einreichung
- 19.12.2024
- Datum der Verteidigung
- 19.03.2026
- Abstract (DE)
- Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Etablierung von Isolationsmethoden zur Gewinnung von primären humanen Hepatozyten (PHHs) und primären humanen Hepatomazellen (PHCs). Nach erfolgreicher Optimierung der Hepatozytenisolation und der Etablierung einer neuen Isolationsmethode für PHCs wurden die Zellen charakterisiert und die Anwendbarkeit der Methoden in humanen in vitro Lebermodellen untersucht. PHHs stellen aktuell den Goldstandard in der Leberforschung dar und werden vorranging in der toxikologischen Forschung für Medikamententestungen oder in der Tumorforschung eingesetzt. Hierbei ist der Anspruch an die Zellqualität und -quantität sehr hoch. Die Ausbeute einer Zellisolation wird maßgeblich von einer Vielzahl an Faktoren beeinflusst. So spielen beispielsweise der Lebensstil, Vorerkrankungen und der gegenwärtige Gesundheitszustand der Patient*innen eine Rolle. Zudem beeinflussen Vorgehen und Ablauf der durchgeführten Operation, z. B. durch die Warmischämiezeit, aber auch die Kaltischämiezeit, der Isolationsprozess sowie dessen Dauer, den Isolationserfolg. Anstelle von offenen Operationen werden zunehmend laparoskopische Eingriffe durchgeführt, da diese Vorteile hinsichtlich der Rekonvaleszenz der Patient*innen bieten. Diese Wandlung erfordert allerdings eine Optimierung des Zellisolationsverfahrens. Aufgrund der verlängerten Ischämiezeiten während der Operation ist die Viabilität der Zellen nach der Isolation meist nur mäßig. Mit der verminderten Ausbeute können die geforderten Qualitätsansprüche oft nicht abgedeckt werden. Folglich können sich die hepatischen Energieressourcen verringern, welche dann zu Zellstress und Zelltod führen. Aus diesem Grund wurde in einer ersten Studie untersucht, wie die Zugabe von Glucose und Insulin als Supplement in der Perfusionslösung die Viabilität und Funktionalität von PHHs beeinflusst. Hierbei wurde analysiert, ob intrazelluläre Glycogenspeicher durch die Supplementation wieder aufgefüllt werden. Weiter wurde untersucht, ob die ischämiebedingte Anpassung des Energiestatus sowie der Glycogengehalt des Gewebes oder der Zellen mit dem BMI der Patient*innen korrelieren. Die Auswertung der Studiendaten zeigte, dass sich die Viabilität und das Überleben der Zellen deutlich durch die Supplementation mit Glucose und Insulin verbesserte. Da hierbei die intrazellulären Glycogenspeicher der Hepatozyten nicht aufgefüllt wurden, legen diese Daten nahe, dass die zusätzlich zur Verfügung gestellte Glucose vollständig aufgebraucht wurde. Die größte qualitative Verbesserung durch die Zugabe von Insulin und Glucose zur Perfusionslösung konnte bei Hepatozyten mit geringen Energiereserven erzielt werden. Diese sterben ansonsten oft während der Isolation oder früh während des Zellkultivierungsprozesses. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Qualität und das Adhärenzverhalten der isolierten PHHs durch ihren Lipidgehalt beeinflusst werden. Die Adhärenz der Hepatozyten verbesserte sich durch Zugabe von Glucose und Insulin zusätzlich. Die Adhärenz zusätzlicher Hepatozytenpopulationen korrelierte mit Veränderungen in der Fähigkeit zur Albumin- und Ureasynthese sowie der Lipidspeicherung. Untersuchungen zur Aktivität und Stabilität von Enzymen des Fremdstoffmetabolismus zeigten, dass die initiale Stabilisierung des Energiemetabolismus keinen Einfluss auf die in vitro Funktionalität der PHHs hat. Die funktionelle Charakterisierung zeigte variierende und donor*innenabhängige Ergebnisse, welche typisch bei der Arbeit mit Primärzellen sind. Dadurch waren nur limitierte statistische Analysen möglich, weshalb der Fokus auf individuelle Werte der einzelnen Zellbatches gelegt wurde. Die Ergebnisse konnten hier mittels verschiedener Analysenmethoden und Messparameter charakterisiert werden. Trotz der Limitationen der Studie konnten Rückschlüsse auf den Einfluss von Ischämie und Hypoxie hinsichtlich der Energieressourcen von isolierten Hepatozyten gezogen werden. Neben PHHs kommen in der Krebsforschung vor allem Zelllinien zum Einsatz. Generell ist in Tumorzellen der Energiestoffwechsel, verglichen mit dem umliegenden Normalgewebe, deutlich verändert. Vor allem der Glucosestoffwechsel läuft verändert unter anaeroben anstatt aeroben Bedingungen ab, was auch als Warburg-Effekt bekannt ist. In einer zweiten Studie wurden deshalb die häufig in der Forschung verwendeten Hepatomazelllinien HepG2 und Huh7 hinsichtlich metabolischer Funktionen untersucht. Diese wurden mit primär isolierten Lebertumorzellen verglichen. Es wurde analysiert, in wie weit diese den Zustand in vivo repräsentieren. Mit der für diese Studie etablierten Methode können erfolgreich PHCs isoliert werden. Es wurde gezeigt, dass die Ausbeute abhängig von Größe und Gewicht der Tumorprobe ist. Eine intensive Charakterisierung anhand von exprimierten Oberflächenmarkern und mRNA-Genexpressionsprofilen zeigten eindeutig Tumorzellen hepatischen Ursprungs. Allerdings war auch eine Kontamination mit Fibroblasten in der Kultur nachweisbar. Die Forschungsergebnisse, basierend auf der metabolischen Charakterisierung durch Genexpression, Proteinexpression und funktionaler Analysen, zeigten, dass PHCs therapeutisch relevante HCC-Tumore deutlich besser repräsentieren als die üblich verwendeten Zelllinien. Diese bilden HCCs in Bezug auf den Energiestoffwechsel in vivo nur partiell ab. PHCs zeigen einen hypoxischen und fastenden metabolischen Phänotyp, welcher bei HCLs nicht nachzuweisen war. Um den Zustand von PHCs durch HCLs abbilden zu können, müssten diese unter sauerstoff- und/oder glucosearmen Bedingungen kultiviert werden. Dadurch würde sich allerdings ein deutlich höherer Kultivierungsaufwand ergeben. Primäre Leberzellen aus HCC-Tumorproben sollten gegenüber HCLs präferiert werden, um die Forschungsergebnisse, die mit Zelllinien generiert wurden, zu bestätigen. Die Ergebnisse legen nahe, dass die histologische Graduierung zu G1 oder G2 Tumoren nicht die komplette Bandbreite an Dedifferenzierung im Tumor abbildet. Außerdem konnte ermittelt werden, dass die Hepatozyten des tumorumgebenden Gewebes bereits Anzeichen einer prä-kanzerogenen Stufe hinsichtlich ihres Energiestoffwechsel aufzeigen. Die Studie war durch die teilweise unzureichenden Ausbeuten an isolierten PHCs limitiert. Folglich konnten nicht die gesamten Analysen auf Transkript-, Proteom- und funktionaler Ebene für einzelne Batches durchgeführt werden. Eine funktionelle Charakterisierung erforderte adhärente Zellen, die sich nicht aus allen Gewebeproben isolieren ließen. Zudem wurden die Zellen zu einem sehr frühen Zeitpunkt der Kultivierung charakterisiert. Es kam dabei zu einer Überschneidung mit Isolationsstress und nachgeschalteten Regenerationsprozessen in der Zelle, die Einfluss auf den Metabolismus haben. Andererseits ist auch bekannt, dass die Kultivierung von PHHs über einen längeren Zeitraum zu deutlichen Dedifferenzierungsprozessen führt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Zelllinien nur bedingt den metabolischen Zustand bzw. die metabolischen Eigenschaften früh differenzierter HCC-Tumore darstellen können. Das Metabolom scheint eine entscheidende Rolle hinsichtlich Dedifferenzierungsprozessen im Tumor zu spielen. Daten zum Tumormetabolismus könnten perspektivisch klinisch genutzt werden z. B. in molekularen Tumorboards, wie sie an manchen Universitätskliniken bereits durchgeführt werden.
- Forschungsdatenverweis
- Effect of glucose and insulin supplementation on the isolation of primary human hepatocytes.
DOI: 10.17179/excli2019-1782.
Link: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31839763/ - Critical Investigation of the Usability of Hepatoma Cell Lines HepG2 and Huh7 as Models for the Metabolic Representation of Resectable Hepatocellular Carcinoma
DOI: 10.3390/cancers14174227
Link: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36077764/ - Freie Schlagwörter (DE)
- Leber, Hepatozelluläres Karzinom, Zellisolation, Metabolismus
- Klassifikation (DDC)
- 610
- Den akademischen Grad verleihende / prüfende Institution
- Universität Leipzig, Leipzig
- Version / Begutachtungsstatus
- angenommene Version / Postprint / Autorenversion
- URN Qucosa
- urn:nbn:de:bsz:15-qucosa2-1039520
- Veröffentlichungsdatum Qucosa
- 21.04.2026
- Dokumenttyp
- Dissertation
- Sprache des Dokumentes
- Deutsch
- Lizenz / Rechtehinweis
CC BY 4.0- Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis IV 1 EINLEITUNG 1 1.1 Aufbau und Funktionen der Leber 1 1.1.1 Die Leber als zentrales Organ des Energiestoffwechsels 2 1.1.2 Fremdstoffmetabolismus in der Leber 4 1.1.3 Syntheseleistungen der Leber 4 1.2 Das Hepatozelluläre Karzinom als primäre Lebertumorerkrankung 5 1.2.1 Prävalenz und Inzidenz des HCCs 5 1.2.2 Ursachen und Risiken der Entstehung des HCCs 5 1.2.3 Veränderungen des Lebermetabolismus im HCC 7 1.2.4 Mögliche Therapien 7 1.3 Einsatz von Leber- und Lebertumormodellen in der in vitro Forschung 10 1.3.1 Primäre Hepatozyten in in vitro Untersuchungen 10 1.3.2 Zelllinien im Vergleich zu Primärzellen in der in vitro Tumorforschung 11 1.4 Ziele der publizierten Studien 12 2 PUBLIKATIONSMANUSKRIPTE 14 2.1 Effect of Glucose and Insulin Supplementation on the Isolation of Primary Human Hepatocytes 14 2.2 Critical Investigation of the Usability of Hepatoma Cell Lines HepG2 and Huh7 as Models for the Metabolic Representation of Resectable Hepatocellular Carcinoma 36 3 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 60 4 LITERATURVERZEICHNIS 63 5 ANLAGEN 68 5.1 Supplemental Materials 68 6 DARSTELLUNG DES EIGENEN BEITRAGS 107 7 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 112 8 LEBENSLAUF 113 9 WISSENSCHAFTLICHE VERÖFFENTLICHUNGEN UND VORTRÄGE 114 9.1 Publikationen 114 9.2 Poster Präsentationen 115 9.3 Weitere Co-Autorenschaften 115 10 DANKSAGUNG 118