- Titel
- Der Einfluss von Magenkarzinom-assoziierten extrazellulären Vesikeln auf das Immunprofil primärer Monozyten
- Zitierfähige Url:
- https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:15-qucosa2-952132
- Datum der Einreichung
- 10.10.2023
- Datum der Verteidigung
- 08.11.2024
- Abstract (DE)
- Monozyten gehören zu den Zellen des angeborenen Immunsystems und sind maßgeblich an der Phagozytose von Pathogenen, an Entzündungsreaktionen, an der Wundheilung und bei der Rekrutierung von weiteren Immunzellen beteiligt. Neuere Forschungen zeigten jedoch, dass Monozyten ebenfalls eine entscheidende Rolle bei Tumorerkrankungen einnehmen. So konnte bei verschiedenen Tumorentitäten beobachtet werden, dass Monozyten pro- und antitumorale Funktionen aufweisen. Sie sind außerdem in der Lage, in tumorassoziierte Makrophagen zu differenzieren, welche zum Tumorgewebe migrieren und den Ausgang der Erkrankung maßgeblich beeinflussen. Tumorassoziierte Makrophagen weisen Eigenschaften der Typ-2 Makrophagen auf und üben eine tumorfördernde Funktion aus, bei der Immunsuppression, 106 Zusammenfassung Angiogenese und Metastasierung begünstigt wird. Magenkarzinome enthalten nicht nur hohe Mengen an tumorassoziierten Makrophagen, sondern beeinflussen außerdem Immunzellen im peripheren Blut über parakrine Faktoren, wie z.B. Extrazelluläre Vesikel (EVs). Sie beeinflussen sowohl physiologische als auch pathologische Prozesse, einschließlich der Karzinogenese. Tumore sekretieren EVs in ihre Umgebung und beeinflussen die Zusammensetzung des Tumormikromilieus. Auch im Blut zirkulieren Tumor-EVs und üben einen funktionsmodulierenden Effekt auf periphere mononukleäre Blutzellen aus. In vielen Fällen wurden immunsupprimierende Eigenschaften von Tumor-EVs nachgewiesen. Besonders bei der Beseitigung von Tumorzellen ist ein intaktes Immunsystem erforderlich. Inwiefern Magenkarzinom-EVs die immunologische Aktivität von Monozyten beeinflussen, ist Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Hierbei sollten insbesondere Magenkarzinom spezifische EVs charakterisiert und ihr Einfluss auf die Zytokin-Produktion von aktivierten Monozyten untersucht werden. Um Magenkarzinom-spezifische EVs zu produzieren, erfolgte die Etablierung der Zellkultur der menschlichen Magenkarzinomzelllinie MKN45 und einer Kontrollzelllinie GES-1. Da depletiertes Medium kaum exogene EVs enthielt und eine uneingeschränkte Proliferation von MKN45 zuließ, bewährte es sich als geeignetes Medium für die Gewinnung von EVs. Untersuchungen mittels „Nanoparticle Tracking Analysis“ zeigten, dass die isolierten EVs eine charakteristische Größe zwischen 100 nm – 400 nm im Durchmesser aufwiesen (Modalwert GES-1: 207 nm; Modalwert MKN45: 169 nm). Die EV spezifischen Tetraspanine CD9, CD63 und CD81 ließen sich mittels durchflusszytometrischer Untersuchungen des Oberflächenproteinprofils nachweisen. Elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigten eine charakteristische EV-Struktur. Nach erfolgreicher Produktion von Magenkarzinom-spezifischen EVs erfolgte die Ko-Inkubation mit primären Monozyten, welche von gesunden Spendern mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation und Gegenstromelutriation gewonnen wurden. Untersuchungen der Genexpression mittels RT qPCR zeigten, dass die Inkubation mit MKN45-EVs in LPS-aktivierten Monozyten zu einer Abnahme der relativen mRNA-Expression der pro-inflammatorischen Zytokine IL-8 und TNF-α, sowie zu einer Zunahme von INF- führt. In Folgeexperimenten konnte nach der Inkubation mit MKN45 eine konzentrationsabhängige Inhibierung der TNF- Produktion auf Genexpressions- und Proteinebene, sowie ein konzentrationsabhängiger Anstieg der IFN- mRNA beobachtet werden. Analog zeigte die Inkubation mit GES-1 EVs eine ähnliche konzentrationsabhängige Inhibierung der TNF--Produktion, jedoch auch eine Hemmung der Genexpression von IFN-Beta. Magenkarzinom- und Kontroll-EVs beeinflussen somit die LPS 107 Zusammenfassung abhängige Induktion von TNF-α und IFN-β. Im Anschluss daran wurde die Untersuchung des zugrunde liegenden Mechanismus durchgeführt. NF-κB ist als Transkriptionsfaktor Toll-like Rezeptor-4(TLR4)-abhängiger Signalwege von großer Bedeutung für die LPS-induzierte Zytokinproduktion. Nach einer Inkubation mit EVs wurde die Phophorylierung von NF-κB in primären Monozyten mittels Western-Blot-Methodik analysiert. Zwar führte die Inkubation mit MKN45 EVs und LPS zu einer erhöhten Phosphorylierung von NF-κB die sich jedoch durch Zugabe von EVs nicht änderte. Die Inkubation mit Tumor-EVs allein hatte keinen Effekt. Somit spiegelte sich die durch die EVs beobachtete Hemmung der LPS-induzierten TNF-a Produktion nicht in den Western-Blot Analysen wider. Es folgten Untersuchungen die den Einfluss sezernierter EVs auf primäre Monozyten, nach Behandlung der GES-1 und MKN45 mit Nikotinamid (NAM) analysierten. NAM ist eine Substanz, die viele zelluläre Prozesse, wie z.b. Energiemetabolismus, Lipidstoffwechsel und DNA-Reperaturmechanismen, maßgeblich beeinflusst und in der Tumortherapie Einsatz findet. Ein Effekt auf die Funktion der EVs auf die TNF-α und IFN-β-Produktion wurde jedoch in der vorliegenden Arbeit ausgeschlossen. Ein weiteres Hauptaugenmerk lag in der Analyse des zellulären Immunstatus der Monozyten von Magenkarzinompatienten. Es wurden Oberflächenproteine der Monozyten aus Vollblutproben von 30 Magenkarzinompatienten (♀ = 22, ♂ = 8, Ø-Alter = 65 Jahre) und 24 altersentsprechenden gesunden Spendern durchflusszytometrisch untersucht. Auffällig war, dass Monozyten von Magenkarzinompatienten eine erhöhte Expression des Oberflächenproteins Carboxypeptidase M (CPM) aufweisen, eine Metallo-Carboxypeptidase, die mit der Makrophagendifferenzierung assoziiert ist. Weiterhin exprimieren Monozyten von Magenkarzinompatienten in höherem Anteil CD33, ein entscheidender Regulator der inflammatorischen Funktion von Monozyten. Im letzten Teil der Arbeit wurde die Rolle des Zytokins TGF- bei der Immunmodulation durch Magenkarzinome diskutiert. Mithilfe des Online-Tools GEPIA2 wurden computergestützte Analysen durchgeführt, die zeigten, dass die Genexpression von TGFB1 bei Magenadenokarzinomen und Ösophaguskarzinomen im Vergleich zu gesundem Gewebe erhöht ist und dass eine gesteigerte Genexpression von TGFB1 bei Patienten mit Magen- oder Ösophaguskarzinom mit einer verminderten Überlebensrate korreliert. Abschließend wurde überprüft, ob das in der vorliegenden Studie verwendete Zellkulturmodell mit den computergestützten Analysen übereinstimmt. Im Vergleich zu GES-1 weisen MKN45 eine doppelt so hohe relative Genexpression von TGFB1 auf. Dieser Befund stimmt mit den oben beschriebenen in silico generierten Ergebnissen überein. Zusammenfassend gelang die 108 Zusammenfassung Entwicklung eines erfolgreichen Protokolls für zur Isolation von EVs aus menschlichen Magenkarzinomzelllinien in hoher Reinheit und Effizienz. Die vorliegende Studie demonstrierte einen immunmodulierenden Effekt der EVs aus GES-1 und MKN45 Zelllinien auf periphere Monozyten. Weiterhin unterlagen periphere Monozyten von Magenkarzinompatienten einer Änderung der Expression der Oberflächenproteine CPM und CD33. Diese Arbeit liefert Hinweise, dass magenkarzinomspezifische EVs antiinflammatorische Effekte auf periphere Monozyten ausüben können. Hierbei spielt möglicherweise ein TGF- abhängiger Mechanismus eine übergeordnete Rolle. Weitere Studien sind notwendig, um die intravesikulären Charakteristika der magenkarzinomassoziierten EVs und deren Interaktion mit Immunzellen zu untersuchen. Das Verständnis der Rolle von EVs bei tumorassoziierten Prozessen könnte perspektivisch zu deren Einsatz im Rahmen zielgerichteter Immunmodulation oder Diagnostik führen.
- Freie Schlagwörter (DE)
- Immunonkologie, Magenkarzinom, extrazelluläre Vesikel, Monozyten
- Klassifikation (DDC)
- 610
- Den akademischen Grad verleihende / prüfende Institution
- Universität Leipzig, Leipzig
- Version / Begutachtungsstatus
- aktualisierte Version
- URN Qucosa
- urn:nbn:de:bsz:15-qucosa2-952132
- Veröffentlichungsdatum Qucosa
- 16.01.2025
- Dokumenttyp
- Dissertation
- Sprache des Dokumentes
- Deutsch
- Lizenz / Rechtehinweis
CC BY 4.0- Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis V 1 Einleitung 1 1.1 Das Immunsystem 1 1.1.1 Die Rolle des Immunsystems und ihre Komponenten 1 1.1.2 Monozyten 3 1.1.3 Die Rolle von Monozyten im Tumorgeschehen 6 1.2 Magenadenokarzinome 7 1.2.1 Beschreibung und Klassifizierung 7 1.2.2 Die Wechselwirkung zwischen Magenadenokarzinom und Immunsystem 7 1.3 Extrazelluläre Vesikel 10 1.3.1 Biogenese und Klassifikation . 10 1.3.2 Isolierung und Charakterisierung 11 1.3.3 Die Immunonkologische Rolle von EVs15 1.4 Nikotinamid 16 1.4.1 Die physiologische Rolle von Nikotinamid 16 1.4.2 Der Einfluss von Nikotinamid auf Immun- und Tumorzellen 17 2 Zielstellung 19 3 Material und Methoden 21 3.1 Menschliche Zelllinien 21 3.2 Geräte und Material 21 3.2.1 Geräte 21 3.2.2 Verbrauchsmaterialien 22 3.3 Software und Web-Tools 23 3.3.1 Software23 3.3.2 Web-Tools . 23 3.4 Chemikalien, Kits und Nährmedien 23 3.4.1 Chemikalien23 3.4.2 Kits 24 Inhaltsverzeichnis II 3.4.3 Puffer und Lösungen25 3.5 Biologische Materialien . 29 3.5.1 Oligonukleotide 29 3.5.2 Antikörper 30 3.5.3 Protein Größenmarker 31 4 Methoden 32 4.1 Zellkultur 32 4.1.1 Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation 32 4.1.2 Gegenstromelutriation 32 4.1.3 Kultur, Stimulation und Ernte von Monozyten 33 4.2 Isolation extrazellulärer Vesikel 34 4.2.1 Herstellung von partikeldepletiertem Zellkulturmedium 34 4.2.2 Entfernung von Zelltrümmern aus Zellkulturüberständen 34 4.2.3 Sequenzielle Ultrazentrifugation zur Pelletierung von EVs34 4.3 Charakterisierung extrazellulärer Vesikel 35 4.3.1 „Nanoparticle Tracking Analysis“ (NTA) 35 4.3.2 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen der Struktur von extrazellulären Vesikeln 35 4.3.3 Beadbasierte Charakterisierung von Oberflächenproteinen von extrazellulären Vesikeln 36 4.4 Molekulare Analyse von Zellen mittels RT-qPCR 36 4.4.1 RNA-Isolation36 4.4.2 DNA-Verdau 37 4.4.3 cDNA-Synthese (Reverse Transkription) 37 4.4.4 QRT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction) 38 4.5 Molekularbiologische Methoden 39 4.5.1 SDS-PAGE und Westernblot 40 4.5.2 TNF-α-Bestimmung im Zellkulturüberstand mittels ELISA 41 4.5.3 Durchflusszytometrische INF-β-Bestimmung im Zellkulturüberstand42 4.5.4 Durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenproteinen von Monozyten aus Vollblut 42 4.5.5 Durchflusszytometrische Analyse von Viabilität, Apoptose und Nekrose 44 Inhaltsverzeichnis III 4.6 Gatingstrategie 45 4.7 Statistik 47 5 Ergebnisse 48 5.1 Isolation von extrazellulären Vesikeln aus Magenkarzinomzelllinien48 5.1.1 Beschreibung der Zelllinien GES-1 und MKN45 48 5.1.2 Herstellung von partikelfreien Zellkulturmedium. 49 5.1.3 Zellproliferation und Viabilität von MKN45 in partikelfreien Zellkulturmedium .. 52 5.1.4 Gewinnung und Quantifizierung von Partikeln der Zelllinien MKN45 und GES-1 55 5.2 Charakterisierung der isolierten Partikel 58 5.2.1 Analyse von Oberflächenproteinen der isolierten Partikel58 5.2.2 Elektronenmikroskopische Untersuchungen der isolierten Partikel 60 5.3 Einfluss von extrazellulären Vesikeln der Magenkarzinomzelllinien auf die Zytokinproduktion und Signaltransduktion von aktivierten Monozyten 62 5.3.1 Analyse der Zytokinantwort von stimulierten Monozyten auf extrazelluläre Vesikel der Magenkarzinomzelllinien 62 5.3.2 Der konzentrationsabhängige Effekt von extrazellulären Vesikeln auf die Produktion von TNF-α und IFN-β 63 5.3.3 Untersuchungen des zeitabhängigen Effekts von extrazellulären Vesikeln auf die Produktion von TNF-α und IFN-β 67 5.3.4 Einfluss von extrazellulären Vesikeln auf die Phosphorylierung von Schlüsselproteinen des TLR4 Signalweges 73 5.4 Einfluss von Nikotinamid auf den Effekt von extrazellulären Vesikeln auf die Zytokinproduktion 76 5.4.1 Untersuchungen des Einflusses von Nikotinamid auf die Zellproliferation und Viabilität von MKN4576 5.4.2 Effekt von extrazellulären Vesikeln auf die Produktion von TNF-α und IFN-β aus Nikotinamid behandelten Zelllinien 77 5.5 Analyse und Vergleich der Expression von Oberflächenmarkern auf primären Monozyten von Magenkarzinompatienten und gesunden Spendern 82 Inhaltsverzeichnis IV 5.6 TGFβ im Magenkarzinom 88 6 Diskussion 92 6.1 Isolation und Charakterisierung von EVs 92 6.2 Immunmodulierender Effekt von Magenkarzinom-EVs auf Monozyten 97 6.3 Der Effekt von Nikotinamid auf die Funktion von Magenkarzinom-EVs100 6.4 Expression von CPM und CD33 auf primären Monozyten von Magenkarzinompatienten 102 6.5 TGFβ im Magenkarzinomgeschehen 104 7 Zusammenfassung 106 8 Literaturverzeichnis 110 8.1 Literaturverzeichnis 110 9 Anlagen 127 10 Selbstständigkeitserklärung, Lebenslauf, Publikationen, Danksagung 134 10.1 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit134 10.2 Lebenslauf 135 10.3 Publikation136 10.4 Danksagung 137